Non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 2 (NCK2) pathways as factor promoting aggressiveness in ovarian cancer.

Mara Fanelli, Alessia Camperchioli, Lella Petrella, Marco Petrillo

et al. IJBM 2018, Vol. 33(1) 124–131

A cura della Dottoressa Francesca Ciccarone 

 

INTRODUZIONE

Il cancro ovarico è la principale causa di morte per neoplasia ginecologica in Europa e Stati Uniti, con oltre 14.000 decessi ogni anno.¹

Negli ultimi dieci anni sono stati fatti progressi importanti nello studio delle basi biologiche di questa neoplasia, portando a riconoscere un coinvolgimento della deregolazione della dinamica del citoscheletro nell’ acquisizione del potenziale metastatico ed è stata definita la resistenza del tumore ovarico agli agenti citotossici, come i taxani.^2,3

Inoltre, l’ angiogenesi tumorale è stata dimostrata rappresentare una caratteristica rilevante nella biologia del cancro ovarico, guidando lo sviluppo di un fenotipo aggressivo.⁴

In questo contesto si colloca la famiglia delle proteine tirosin-chinasi (proteine adattatrici NCK), costituita da Nck1 e Nck2. In particolare, diversi studi hanno rivelato che la famiglia Nck media il rimodellamento del citoscheletro, indotto da fattori pro-angiogenici, consentendo alle cellule endoteliali una migrazione direzionale.^5,6

Ciò suggerisce che le proteine NCK possono esercitare un ruolo nel complesso processo della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), con un conseguente impatto negativo sulla prognosi dei pazienti.

Lo scopo del presente lavoro è stata la valutazione del ruolo della proteina NCK2 correlata alle integrine ITGB1 e ITGB4 nel mediare l’aggressività del carcinoma ovarico ed è stato valutato come NCK2 e le integrine possano influenzare la prognosi nelle pazienti con tumore ovarico.

METODI

Al fine di ottenere informazioni sul ruolo di Nck2 e delle integrine ITGB1 e ITGB4 in vivo, è stata analizzata retrospettivamente una coorte clinica di 332 pazienti con carcinoma ovarico utilizzando un analizzatore genetico nanofluidico (Tabella 1)^7,8

Per valutare l’espressione di NCK2, delle integrine e del VEGFA è stata eseguita una Real Time PCR in linee cellulari di cancro ovarico. Inoltre è stato valutato il ruolo della proteina Nck2 nell’aggressività del tumore ovarico in vitro, over-esprimendo la proteina in esame nella linea cellulare OVCAR3. Real Time PCR e Western Blot sono stati eseguiti per valutare l’espressione di VEGFA, Vimentina, ITGB1, ITGB4, MMP2 e MMP9 a livello genico e proteico.

L’espressione di alcuni geni, quali Vimentina, MMP2 e MMP9 sono stati analizzati in condizioni di normossia e di ipossia.^7,9,10

La Co-Immunoprecipitazione (Co-IP) è stata eseguita nelle cellule di tumore ovarico A2780 al fine di confermare un’interazione tra NCK2 e le proteine di interesse.

È stato effettuato un saggio soft agar per valutare se l’espressione e l’attività di Nck2 sono fondamentali nella tumorigenesi e se l’over-espressione di Nck2 favorisce la progressione del tumore e l’aumento della crescita ancoraggio-indipendente delle cellule.

Il saggio di invasione Transwell è stato effettuato su cellule OVCAR-3 transfettate stabilmente con il vettore pUSE-Nck2.

 RISULTATI E CONCLUSIONI

In questo studio viene fornita la prova del ruolo di Nck2 nel mediare l’aggressività del cancro ovarico in combinazione con altri partner collegati all’EMT e all’angiogenesi tumorale.

I risultati ottenuti in vivo mediante l’analisi traslazionale sembrano supportare l’ipotesi che Nck2 ha un ruolo importante come fattore di aggressività nel cancro dell’ovaio. Alti livelli di espressione di Nck2 sembrano essere correlati ad una prognosi negativa, con una significatività statistica (p=0.0001); contrariamente, bassi livelli di Nck2 sono correlati ad una lunga sopravvivenza. In particolare, i risultati dell’analisi traslazionale hanno evidenziato che ITGB1 e NCK2 presentano un RR >1 significando che sono fattori prognostici sfavorevoli; ITGB4 invece ha RR< 1 e quindi è un fattore prognostico favorevole.

Nck2, infatti, insieme all’integrina β1, rappresenta un fattore prognostico negativo nelle pazienti affette da carcinoma ovarico, essendo questi fattori up-regolati nei casi in cui la malattia risultava più aggressiva e la sopravvivenza più limitata.^11,12

Dai dati di Real-time PCR e Western blot, NCK2 può essere correlato all’ angiogenesi poichè agisce su VEGFA, gene coinvolto in questo processo. La Co-IP ha mostrato però una relazione indiretta in quanto NCK2 lega direttamente ITGB1, ma non VEGFA.

Per la prima volta nello studio del carcinoma ovarico, viene fornita una prova che Nck2 svolge un ruolo essenziale nel coordinamento di fattori chiave associati alla proliferazione, al fenotipo metastatico e pertanto all’aggressività delle cellule tumorali nel cancro ovarico.

Quando le cellule sono esposte a stress nel microambiente tumorale, reagiscono attivando un percorso che coinvolge geni legati alla EMT e all’angiogenesi. Le cellule tumorali che non riescono a crescere in tali condizioni ambientali, sono quelle in grado di innescare il programma di sopravvivenza che coinvolge NCK2, determinando in tal modo la crescita di cellule tumorali con un fenotipo più aggressivo.^13,14

È stato dimostrato che l’espressione ed il livello di attività di Nck2 sono fondamentali per la tumorigenesi. Si è evidenziato, inoltre, che l’over-espressione di Nck2 favorisce l’aumento della crescita ancoraggio-indipendente delle cellule, ma non conferisce alle cellule la capacità invasiva.^15,16

Sulla base di questi dati, possiamo ipotizzare l’esistenza di pathway regolatorio tra NCK2, vimentina e integrine, in cui NCK2 potrebbe essere collocato come regolatore a monte.

In conclusione, questo lavoro dimostra che le pazienti che si presentano alla prima chirurgia con alti livelli di Nck2 hanno elevata probabilità di mostrare una malattia aggressiva e farmaco-resistente.

Questi dati supportano altresì la necessità clinica di trovare alternative terapeutiche per queste pazienti e lo sviluppo di inibitori di Nck2. Questo studio potrebbe portare a considerare, quindi, in studi futuri, Nck2 come un potenziale biomarcatore per la terapia molecolare anti-cancro nelle pazienti affette da carcinoma ovarico.

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